复乳溶剂挥发法制备氧化苦参碱脂质体

　氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)是从中药苦参和苦豆子中提取的有效成分,是近年来临床治疗肝炎效果较好的药物之一[1],国内已广泛用于乙型肝炎的临床治疗[2]。但是该药全身分布,消除半衰期短,而且该药在肝脏中的有效血药浓度持续时间短[34]。脂质体作为一种药物载体,可以被动靶向到肝脾等网状内皮系统丰富的器官,从而较多地分布于肝脏,提高药物在肝脏中的浓度,且能维持药物的释放时间[5]。OMT在水中的溶解度大于1(g·m)/L,是一个亲水性很强的弱碱性小分子药物,其结构式见图1.

　　文献介绍的复乳法制备的脂质体采用的磷脂浓度比较低,且药脂比亦较低[6],本研究试用较高药脂比(mol:mol,1:1)和较大原料药浓度(约16.1 mg/ml,8.05 mg/ml)来制备氧化苦参碱脂质体,采用粒度测定仪分析有机溶剂挥发后其粒径大小的分布情况,并采用超声法对其粒径进行了进一步的减小。并且通过微孔滤膜超滤HPLC法对其包封率进行了测定。

　　1 仪器与试药

　　高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司);扫描电子显微镜(日本Hitachi公司);微粒粒度测定仪(英国Beckman公司);高速均质机(广州,UITRA TURRAX,T18Basic);DZDW2型电子恒温不锈钢水浴锅(上海路达实验仪器有限公司);Amicon 8010 搅拌超滤器(美国Milipore公司);PHS2C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂);Adventure AR1140电子天平(美国Ohaus 公司);DF10B集热式恒温磁力搅拌器(浙江省乐清县乐成仪器厂)。

　　氧化苦参碱(纯度>98%,连云港正大天晴有限公司);超滤膜(截流分子量10万,上海亚东核极树脂有限公司),氯仿(分析纯,天津市博迪化工有限公司);甲醇(色谱纯,天津康科德有限公司);Triton100(北京化工厂)。

　　2 方法与结果

　　2.1 复乳溶剂挥发法制备氧化苦参碱脂质体

　　根据文献报道,复乳溶剂挥发法是少量的缓冲盐与多量的有机溶剂进行第一次乳化,形成W/O型反胶团,减压除去一部分或完全不除去溶剂,然后加入大量的缓冲液进行第二次乳化,形成W/O/W的复乳系统[67],并进行除去溶剂最终得到脂质体的过程。本实验欲考察2次乳化除溶剂时,生理盐水和蒸馏水的使用以及不同水浴温度对氧化苦参碱脂质体包封率的影响。

　　2.1.1 油相及水相储备液的制备称取83 mg注射用大豆磷脂,胆固醇20.8 mg,配制10 ml氯仿溶液;称取80.5 mg注射用大豆磷脂,胆固醇20.1 mg,配制10 ml 乙醚溶液;称取1 600 mg氧化苦参碱,用去离子水定容至10 ml.

　　2.1.2 脂质体的制备与形态观察取溶有注射用大豆磷脂和胆固醇的氯仿储备溶液,乙醚储备溶液各1 ml.溶有氧化苦参碱的去离子水溶液各1 ml,其中大豆磷脂︰氧化苦参碱︰胆固醇(w:w:w)=4:1:1,置于10 ml的小试管中,在7 500 r/min均质机下均质5 min,得W/O型乳剂,立即将该W/O乳剂倾入水浴温度为40 ℃,装有10 ml生理盐水的圆底烧瓶中,搅拌2 h除去有机溶剂,得氧化苦参碱脂质体。

　　按同样方法操作,水化介质改为20 ml的生理盐水、10 ml纯净水、20 ml纯净水制备脂质体,每组3份。在45 ℃、55℃下,上述水化介质条件下制备脂质体,每样也制备3份。

　　此外,另取溶有大豆磷脂和胆固醇的氯仿溶液1 ml置茄形瓶中,在50 ℃条件下真空除去有机溶剂使脂质材料在瓶壁内形成均匀的薄膜。40 ℃条件下5 ml氧化苦参碱储备液水化4 h,将所得脂质体粗分散液分别通过2次0.8 μm,2次0.45 μm,3次0.22 μm,3次0.1 μm微孔滤膜进行整粒。

　　以45 ℃,10 ml生理盐水条件下制备所得脂质体混悬液为例,观察脂质体的微观形态并对其粒度分布进行了测定。在4 ℃储存2周后经过扫描电镜观察发现有颗粒状脂质体的形成(图2),图中板状晶体可能是高浓度的氧化苦参碱在干燥时析出所致。

　　采用Beckman粒度测定仪对由复乳溶剂挥发法制备所得脂质体粗混悬液体积径分布的测定结果(见图3A)。未被超声时,得到的脂质体粒度分布非常宽且不均一,甚至有10～30 μm的大粒子出现。而超声过后的脂质体粒度分布变窄且粒径有较大幅度的减小,较大粒子在体系中所占比重也相应减小。同时,以采用薄膜水化分散微孔滤膜挤出法制得的粒径分布较为均一的脂质体(图3B)作为对照说明。

2.2 氧化苦参碱脂质体包封率的测定方法

　　2.2.1 氧化苦参碱含量测定HPLC条件色谱柱:DiamonsilODS 柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),接预柱,流动相:甲醇︰磷酸盐缓冲液(含50 mm磷酸,三乙胺调pH 3.5)(20∶80,v∶v),波长:220 nm,流速:0.8 ml/min,柱温:室温,进样量:20 μl.

　　2.2.2 脂质体中总药量的测定方法脂质体中总药量的测定方法采用TritonX100破坏法测定,具体操作参见文献[8]。

　　2.2.3 方法回收率考察采用复乳溶剂挥发法制备空白脂质体,并取空白脂质体0.2 ml各3份置10 ml容量瓶中,分别加入9.85 mg/ml的氧化苦参碱药物溶液0.16、0.20、0.24 ml,得到3种不同浓度药物的脂质体混悬液。向各样品中滴加10%曲拉通溶液,超声溶解至出现澄明溶液,加入蒸馏水定容至刻度。同法不加入脂质体,制备上述3种浓度的药物溶液,液相色谱法测定上述样品溶液的色谱峰峰面积。3次实验的回收率分别为98.1%、97.5%、99.3%.可见,TritonX100可以很好地破坏脂质体,使药物完全从脂质体中溶解出来,同时TritonX100与药物之间无相互作用,对药物含量测定无影响,可以用于测定脂质体中药物含量。回收率计算公式见下:

　　Recovery rate = AOMT in limsomes/ AOMT in solution × 100%

　　2.3 复乳溶剂挥发法制备氧化苦参碱脂质体包封率结果

　　不同水化温度、水化体积和水化介质下的包封率见表1.表1 不同水化温度、水化体积和水化介质下的包封率(n=3)

　　3 讨论

　　通过扫描电子显微镜发现采用复乳溶剂挥发法可以制得脂质体,但采用此法制备氧化苦参碱脂质体时,由于药物在水中的溶解度较大,并且该制备方法在水化即挥发有机溶剂过程中时间较长,这时会有大量药物从脂质体中渗漏进入外水相,导致其中药物包封率很低。

　　去离子水水化过程中,在45 ℃时的包封率可达到15%以上,而生理盐水水化组的包封率普遍较低,这可能是由于包封进脂质体内水相的氧化苦参碱由于高浓度的盐溶液使其在水中析出小结晶的结果。

　　复乳法很难制备成功单位体积高载药量脂质体,表现为药物的包封率较低,绝大多数条件下制得的样品包封率小于10%,当溶液中离子强度较大时,其包封率可达到15%左右,说明采用复乳法制备单位体积高载药量氧化苦参碱脂质体有一定的难度。包封率相对较高的制备工艺所得样品在25 ℃存放1个月后有药物结晶析出。

　　文献报道的氧化苦参碱HPLC测定方法较多,其中包括制剂中[910]、溶出介质中[11]及血浆样品中[12]氧化苦参碱的检测,我们采用了杜松等[13]报道的脂质体中氧化苦参碱的测定方法,该法符合HPLC方法学要求,并且具有HPLC进样样品制备简单的特点。并且,采用已有报道的超滤法分离载药脂质体与外水相中的游离药物,测定药物的包封率。

　　Tomoko Nii等曾报道采用此法来制备水溶性小分子药物5氟尿嘧啶的脂质体,并研究了该法中各种制备因素对药物包封率的影响[6],发现采用该法制备的脂质体对水溶性小分子药物包封率较低,约在15%以下。本实验结果与文献报道的情形较为相符[6]。我们认为王汀等[14]报道的复乳溶剂冻干法可能是提高氧化苦参碱脂质体包封率的一条途径。

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