膜分离技术提取分离抗生素FKR1565

膜技术是当代高效分离技术，具有高效、节能、过程易控制、操作方便、少污染、易与其它技术集成等优点，已在抗生素(如红霉素、土霉素、四环素、螺旋霉素、青霉素、6APA等)产品的生产上得到应用［1～4］。本文作者在抗生素FKR1565的中试生产中采用超滤和纳滤膜技术结合的新工艺进行了提取分离，取得理想效果，现将结果报道如下。

    FKR1565为水溶性抗肿瘤抗生素，分子量约为300，稳定性差，对酸、碱特别是对热极不稳定，粗提物的原生产工艺流程为：发酵液过滤(去渣)后，清液经离子交换树脂吸附，稀氨水洗脱，洗脱液真空浓缩(40℃以下)，得粗提物。

    上述工艺在操作时存在两个缺点：一是过滤后的清液量大，树脂吸附时间长，同时清液中还存在色素、蛋白质等杂质，未加处理直接用离子交换树脂吸附，影响了树脂的吸附和再生；二是对洗脱液进行真空浓缩时，为避免FKR1565分解，温度应控制在40℃以下，这对真空浓缩水溶液是非常困难的，对设备真空度的要求很高。对此，我们在生产中采用了超滤和纳滤膜技术结合的新工艺，取得理想效果。

    新工艺流程为：发酵液过滤(弃渣)后，清液经超滤所得清液再经纳滤，得到的清液经离子交换树脂吸附，稀氨水洗脱，洗脱液纳滤浓缩(室温)，得粗提物。

    新工艺首先用超滤膜对过滤后清液进行预处理，去除色素等杂质，然后将超滤后清液用纳滤膜设备浓缩至原体积的一半，由于杂质减少和体积缩小，树脂吸附时间缩短了一半以上，改善了吸附效果，再生处理也更加容易。浓缩阶段用纳滤膜浓缩替代真空浓缩，洗脱液体积浓缩了10倍以上，避免了样品的分解。

    1  实验材料和仪器设备

    1.1  发酵液

    抗生素FKR1565发酵液来自福建省微生物研究所。

    1.2  仪器设备

    超滤、纳滤膜装置由北京大井易通科技发展有限公司提供，膜为美国KOCH公司产品，其中超滤膜型号为HFK328卷式超滤膜，膜面积6.8M2，截留分子量5000；纳滤膜型号为TFC4040卷式纳滤膜，膜面积7.2M2，截留分子量200。

    高压液相色谱仪为日本岛津LC10Atvp，检测器SPD10Avvp；检测所用分析柱Hypersil BDS C8(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为0.05mol/L (NH4)2HPO4∶CH3OH∶CH3CN(950∶25∶25)；流速1ml/min；柱温20℃；进样量10μl。

　　2  试验过程

    2.1  发酵清液的超滤和纳滤处理

    将发酵液经板框过滤后得到的清液在工作压力0.6MPa、温度20℃～25℃条件下进行超滤处理，膜通量为50～60L/h。超滤后母液中补水4～6倍体积，继续超滤，使母液中检测不出FKR1565。对超滤后的清液在工作压力1.8～2.0MPa、温度18℃～22℃条件下进行纳滤浓缩，使体积减少一半。分别测量超滤前清液、超滤后母液和纳滤后浓缩液的体积并取样，高压液相色谱分析计算FKR1565的收率和纳滤的截留率，并比较它们的澄清度。
2.2  氨水洗脱液的纳滤浓缩

    将氨水洗脱液在工作压力1.8～2.0MPa、温度18℃～22℃条件下进行纳滤浓缩，分别测量氨水洗脱液、纳滤后浓缩液和清液的体积并取样，高压液相色谱分析计算FKR1565的收率和纳滤的截留率。

    3  结果和讨论

    3.1  发酵清液超滤和纳滤处理前后比较

    (1)色泽度  对超滤前清液、超滤后母液、纳滤后浓缩液和透过清液的色泽度进行比较，颜色从深到浅的次序为超滤后母液，超滤前清液，纳滤后浓缩液和透过清液。用高压液相色谱对纳滤后透过清液进行分析，检测不到FKR1565，说明超滤处理能够除去色素等杂质，所使用的纳滤膜对FKR1565的截留效果很好。

    (2)收率和截留率  超滤后母液中补水4～6倍体积后继续超滤，并用高压液相色谱法进行分析，母液中检测不出抗生素FKR1565。取纳滤后透过清液进行高压液相色谱分析，也检测不出FKR1565，说明经过超滤和纳滤处理后，FKR1565的收率和纳滤的截留率均接近100%，对纳滤后浓缩液直接进行HPLC分析的数据也证明这一结果。

    (3)分离效果  分别取发酵清液和纳滤后浓缩液进行高压液相色谱分析(图略)，经过超滤纳滤处理后，杂质FKR2132和其它杂质峰4的面积有很大的减少，杂质FKR2132尤为明显。这是因为FKR2132的水溶性差，在室温下经过纳滤浓缩后溶解性降低，析出固体。FKR2132具有抗病毒作用，分子量与FKR1565相近，两者化学结构相似，用色谱方法不易分离。由于它们的水溶性差别很大，采用纳滤浓缩处理可以达到分离FKR1565与FKR2132的目的。对析出的FKR2132固体进一步纯化后可获得高纯度样品，其高压液相色谱分析主要为杂质FKR2132，仅极少量为杂质FKR1565(图略)。

    3.2  氨水洗脱液的纳滤浓缩结果

    取氨水洗脱液纳滤浓缩倍数约为2.5、6和14时的浓缩液和清液，分别用HPLC方法测定FKR1565效价，并与氨水洗脱液的效价进行比较(表1)，从2.5和6倍纳滤浓缩洗脱液效价可以看出纳滤浓缩的截留率达到99%以上，两次纳滤，即对纳滤后的清液再进行纳滤处理后，浓缩倍数约为14倍，截留率达到99.5%以上。表1    洗脱液和不同纳滤时段浓缩液以及清液中FKR1565的效价树脂吸附试验初步结果还表明，经过超滤处理和纳滤浓缩，除了部分色素和杂质以及体积缩小了一半，树脂吸附时间缩短了一半以上，树脂吸附量和洗脱收率也有所提高，树脂再生处理也更容易，这方面的工作有待于进一步试验和总结。

    4  结论

    将超滤和纳滤膜技术相结合的新工艺应用于抗生素FKR1565的中试生产试验，产品最终的浓缩倍数在10倍以上，截留率高于99%，明显优于真空浓缩的效果，达到了减少杂质，提高收率，防止降解，操作简便的目的。

【参考文献】
  ［1］李十中. 表面化学原理和膜技术在药物分离与纯化过程中的应用［J］. 中国抗生素杂志，2005，30(1)：15～19.

［2］顾觉奋. 膜分离技术在微生物制药中的应用［J］. 中国抗生素杂志，2005，30(1)：26～31.

［3］李秀芬，付学起. 膜分离技术在抗生素提炼过程中的应用［J］. 膜科学与技术，2001，21(1)：45～48.

［4］谢全灵，何旭敏，夏海平，等. 膜分离技术在制药工业中的应用［J］. 膜科学与技术，2003，23：180～185.